HPLC的分离原理是基于溶于流动相中的各组分经过固定相时，因与固定相发生吸附、分配、排阻、亲和等作用的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间各异，从而先后流出固定相1。具体作用机制包括吸附作用（组分被固定相表面吸附能力不同）、溶解 - 扩散作用（组分在流动相和固定相间溶解度差异影响移动速度）、离子交换作用（带电组分与固定相离子交换位点交换反应）、分子筛作用（固定相孔径不同，不同大小分子通过受阻程度不同）。
主要类型
液 - 固吸附色谱：流动相为液体，固定相为固体吸附剂，依据物质吸附作用不同分离物质。
液 - 液分配色谱：流动相和固定相均为液体，利用样品组分在两种不相溶的液相间分配分离。流动相极性小于固定相极性的为正相分配色谱法，反之则为反相分配色谱法。
离子交换色谱：基于离子交换原理实现分离。
离子对色谱法：通过形成离子对来改善分离效果。
分子排阻色谱法：利用固定相孔径大小分离不同分子量的化合物。
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