HPLC检测核糖核苷酸的步骤

 检测原理概述

HPLC基于核糖核苷酸在固定相（如硅胶柱）和流动相（缓冲液）间分配系数差异实现分离，通过检测器（紫外/荧光）定量，峰面积与含量成正比。

🧩 关键步骤详解

1. 样品前处理

提取：使用缓冲液（如磷酸盐缓冲液）溶解样本，超声或离心去除蛋白等杂质。

净化：经0.22μm滤膜过滤，确保无颗粒物堵塞色谱柱。

2. 仪器与条件设置

项目 推荐参数 备注

色谱柱 C18键合硅胶柱（150mm×2.1mm, 2.7μm） 如Agilent AdvanceBio系列

流动相A 0.05M TEAB（pH7.5）+1‰ TFA 离子对试剂增强保留

流动相B 乙腈 梯度洗脱溶剂

洗脱程序 0-25min，5%-15%B相 优化分离效率

柱温 60℃ 提升分离度

流速 0.3mL/min 平衡分离速度与峰形

检测波长 260nm（紫外检测器） 核酸特征吸收峰

3. 进样与检测

进样体积：10μL，自动进样器注入。

检测器：紫外检测器（常规）或荧光检测器（高灵敏度需求，检测限达皮摩尔级）。

4. 数据处理

采用面积归一化法计算纯度，对照标准品峰面积定量核糖核苷酸浓度。

✅ 要点回顾

HPLC检测核糖核苷酸的核心在于 “前处理净化+梯度洗脱+高温柱温”，需严格控制流动相pH与离子对试剂浓度，以实现腺苷酸、鸟苷酸等异构体的基线分离。